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霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

簡要描述：霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒注意事項：．基礎程序；2．擴增溫度和延伸溫度；3．反應時間；4．循環次數；5．PCR 反應液的配制；6．PCR技術的基本原理；7．PCR的反應動力學；8．PCR擴增產物；9．PCR反應體系與反應條件。

產品型號：GY-L02109
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更新時間：2023-02-24 00:00:00
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【產品名稱】霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒

【型號：】GY-L02109

【包裝規格】50次/盒

【產品及特點】霉菌是真菌的一種，其特點是菌絲體較發達，無較大的子實體。同其他真菌一樣，也有細胞壁，寄生或腐生方式生存。霉菌有的使食品轉變為有毒物質，有的可能在食品中產生毒素，即霉菌毒素。自從發現以來，霉菌與霉菌毒素對食品的污染日益引起重視。對人體健康造成的危害極大，主要表現為慢性中毒、致癌、致畸、致突變作用。本產品就是以探針法熒光定量PCR技術為基礎開發的專門檢測霉菌通用的試劑盒，它具有下列特點：

1.即開即用，用戶只需要提供樣品DNA模板。

2.引物和探針經過優化，靈敏性高。

3.提供陽性對照，便于區分假陰性樣品。

4.特異性高，引物是根據霉菌通用DNA高度保守區設計，不會跟其他微生物的DNA發生交叉反應。

5.既可用于定性檢測，又可用于定量檢測。用于定量檢測時線性范圍至少為5個數量級。

6.本產品足夠50次20μL體系的探針法熒光定量PCR反應。

7.本產品只能用于科研。

霉菌通用探針法熒光定量PCR試劑盒【規格及成分】

成分	規格
A	500 μL
B	1 mL
C	1 mL
D	150 μL
E	50 μL
使用手冊	1份

【運輸及保存】低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。

【自備試劑】 樣品 DNA。

【使用方法】一、稀釋標準曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產品穩定性和避免擴散傳染性病原，本產品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的DNA片段作為陽性對照。

1.標記6個離心管，分別為6，5，4，3，2，1。

2.用帶芯槍頭分別加入45 μL熒光PCR專用模板稀釋液，用帶芯槍頭，下同。

3.在6號管中加入5 μL 1×10E7拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

4.換槍頭，在5號管中加入5 μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

5.換槍頭，在4號管中加入5 μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。

6.重復上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。

二、樣品 DNA 的制備

7.如果有N個樣品待提取，設置N+2個提取，多出的是PC（樣品制備陽性對照）和NC（樣品制備陰性對照）。可以取陽性對照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規定體積一致，以此作為PC。另外用水作為NC。

8.用自選方法純化樣品的DNA，本試劑盒跟市場上大多數兼容。

三Probe qPCR反應（20μL體系，在樣品制備室進行）

9.如果做定量分析并且只做1次重復，則標記N+9個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR

陰性對照（用水做模板），6個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做1次重復，則標記N+4個PCR管，其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品，1個用于PCR陰性對照（用水做模板），1個用于PCR陽性對照（用第4號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。

10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢后才設置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：

成分	樣品管 N+2 個	PCR 陰性對照	標準曲線樣品管（1-6 管）
A	10 μL	10 μL	10 μL
D	3 μL	3μL	3 μL
N+2個待測DNA模板	7 μL	-	-
C	-	7 μL	-
第6步所得標準曲線樣品稀釋液（1-6號）	-	-	7 μL（1 號樣到 1 號管，2 號樣到 2 號管…）

11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數進行 PCR：

過程	溫度	時間
預變性	95℃	10 min
PCR反應（45個循環）	95℃	15 sec
PCR反應（45個循環）	60℃	60 sec（采集FAM通道的熒光信號）

四、數據處理

12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。

13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則為陰性，如果小于 40，則為陽性。

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